2.1 Mikrorozmnażanie, Leśnictwo SGGW Warszawa, Szkółkarstwo leśne

2.1 Mikrorozmnażanie

2.1 Mikrorozmnażanie, Leśnictwo SGGW Warszawa, Szkółkarstwo leśne

[ Pobierz całość w formacie PDF ]
2.1 Mikrorozmnażanie
Mikrorozmnażanie, czyli rozmnażanie klonalne lub mikropropagacja, jest jednym z
najważniejszych praktycznych zastosowań roślinnych czystych kultur. Termin ten oznacza
wykorzystanie hodowli
in vitro
do masowego rozmnażania wegetatywnego roślin
. Oczywiście
cząstka "mikro-" w nazwie tej techniki odnosi się jedynie do ilości wyjściowego materiału
biologicznego, natomiast liczba uzyskiwanych w ten sposób roślin potomnych może być bardzo
wysoka. Poza wysokim współczynnikiem rozmnożenia (proporcją liczby uzyskanych roślin do
wyjściowej liczby roślin użytych do rozmnażania) zaletą tej techniki jest bardzo duże wyrównanie
genotypowe i fenotypowe produkowanych roślin, charakterystyczne zresztą dla wszystkich metod
rozmnażania wegetatywnego. Wyrównaniu właściwości roślin sprzyja też fakt, że
mikrorozmnażanie prowadzi się w dokładnie kontrolowanych warunkach laboratoryjnych. Ścisła
izolacja hodowanego materiału od zewnętrznego środowiska, ułatwia otrzymanie roślin wolnych od
patogenów i szkodników a także uniezależnia produkcję od miejscowych warunków
geograficznych, klimatycznych itp. Z drugiej strony, praca w warunkach laboratoryjnych pociąga za
sobą znaczne koszty produkcji, bo urządzenie laboratorium i jego eksploatacja są niewątpliwie
wielokrotnie droższe w porównaniu z bardziej tradycyjnymi metodami produkcji roślin. W związku
z tym technika ta wykorzystywana jest obecnie głównie w odniesieniu do roślin, których cena
jednostkowa jest stosunkowo wysoka, na przykład roślin ozdobnych, drzew i krzewów owocowych
lub leśnych, a także cennych materiałów hodowlanych i gatunków zagrożonych wyginięciem.
Argumentem przemawiającym za wykorzystaniem tej techniki w produkcji sadzonek drzew leśnych
jest fakt, że w odniesieniu do tych gatunków nie istnieją, albo mało skuteczne są prostsze metody
rozmnażania wegetatywnego, natomiast kwitnienie i owocowanie tych roślin następuje dopiero gdy
osiągną wiek kilkudziesięciu lat. Do mikrorozmnażania wystarczy pobrać niewielki fragment
młodej siewki, gdy tylko stwierdzimy, że właśnie ta roślina wykazuje korzystne cechy fenotypowe.
Ze względu na pracochłonnośc i wysokie koszty produkcji mikrorozmnażanie nie ma obecnie
znaczenia w towarowym rolnictwie, bo przy masowości produkcji rolniczej cena pojedynczej
rośliny musi być tu bardzo niska. Nawet jednak rośliny typowo rolnicze, np. ziemniak, bywają
poddawane mikrorozmnażaniu, lecz nie przez rolników - producentów, ale hodowców. Dzięki temu
z pojedynczych wyselekcjonowanych roślin można uzyskać zdrowy i wyrównany materiał
mateczny, który potem dodatkowo powiela się metodami już bardziej tradycyjnymi i tańszymi.
Można wyróżnić następujące główne sposoby mikrorozmnażania:
1. hodowle wierzchołków pędów; jest to forma wzrostu uorganizowanego - wierzchołki pędów
rosną, ukorzeniają się, po czym zostają adaptowane do warunków
ex vitro
i wykorzystane
jako sadzonki); odcinek pędu stosowany w tej metodzie ma zwykle długość od kilku
milimetrów do kilku centymetrów i zawiera zarówno merystem wierzchołkowy jak i
towarzyszące mu zawiązki liści; możliwe jest też regenerowanie roślin ze znacznie
mniejszych eksplantatów (długości poniżej 1 mm), zawierających niemal wyłącznie tkankę
merystematyczną; jednakże izolowanie merystemów, a nie wierzchołków pędów, będąc
techniką dość pracochłonną, stosuje się w nieco innych celach niż mikrorozmnażanie i
omówione jest dokładniej w dalszej części tego skryptu
2. pobudzenie rozwoju pąków bocznych w hodowlach odcinków pędów to metoda bardziej
uniwersalna i dużo częściej stosowana niż poprzednia; eksplantatami są węzły łodygi
(odcinki z których wyrastają liście); u nasady liści występują uśpione pąki boczne (zwane
też pachwinowymi), które w wyniku izolacji eksplantatu, a czasami także pod wpływem
występujących w pożywce cytokinin, wznawiają wzrost i tworzą pędy, wykorzystywane
następnie podobnie jak w poprzedniej metodzie; również ta metoda opiera się na zjawisku
uorganizowanego wzrostu
in vitro
- komórki eksplantatu realizują program rozwojowy,
który został im przypisany jeszcze w warunkach
in vivo
);
3. powstawanie pąków przybyszowych bezpośrednio w tkankach eksplantatu - o tej drodze
regeneracji mówimy, gdy zawiązki pędów tworzą się w kulturze
in vitro
od nowa, w wyniku
przeprogramowania komórek eksplantatu, tzn. eksplantat nie zawierał pąków; utworzyły się
dopiero w kulturze
in vitro
; mamy tu więc do czynienia nie tylko ze wzrostem
uorganizowanym, ale wcześniej jeszcze z organogenezą pędową (kaulogenezą); jeśli
organogeneza nie jest poprzedzona powstaniem kalusa nazywamy ją bezpośrednią; poza
kaulogenezą, drugą podstawową formą organogenezy jest ryzogeneza, czyli tworzenie się
przybyszowych korzeni; o ile jednak z pędu zazwyczaj łatwo i szybko daje się odtworzyć
pełną roślinę, to z korzenia udaje się to dosyć rzadko, dlatego ryzogeneza praktycznie nie
bywa stosowana do mikrorozmnażania roślin
4. powstawanie pąków przybyszowych z komórek kalusa - organogeneza pędowa pośrednia;
zjawisko podobne do opisanego w poprzednim punkcie, ale w tym przypadku komórki
eksplantatu najpierw odróżnicowują i namnażają się, wytwarzając kalus, a dopiero niektóre
komórki kalusa przystępują do odtwarzania rośliny;
5. powstawanie zarodków somatycznych bezpośrednio w tkankach eksplantatu - bezpośrednia
somatyczna embriogeneza (to bardzo pożądany sposób rozmnażania roślin - odpada
konieczność ukorzeniania pędów; zarodki tworzą się od razu, nie trzeba czekać na rozwój
kalusa; zwykle jednak nie jest tak pięknie - częściej udaje się zastosować metodę poniższą)
6. powstawanie zarodków somatycznych z komórek kalusa - somatyczna embriogeneza
pośrednia (wadą tej metody jest obserwowana często niestabilność genetyczna komórek
kalusa; zachodzą w nich spontanicznie zmiany, które powodują, że regenerowane w ten
sposób rośliny nie są tak wyrównane jak można by oczekiwać po metodzie wegetatywnego
rozmnażania).
Przedstawiona tu terminologia nie jest całkiem powszechnie uznawana. Niektórzy badacze za
mikrorozmnażanie uznają tylko techniki wymienione w punktach 1-2. W ujęciu nieco mniej
rygorystycznym do mikrorozmnażania zalicza się wszystkie powyższe techniki, poza opartymi na
somatycznej embriogenezie (p. 5, 6). Niemniej, na naszych zajęciach będziemy trzymać się
powyższego schematu (podążając z grubsza za sugestią prof. Murashigego) i do mikrorozmnażania
zaliczać będziemy wszystkie metody wymienione w punktach 1-6.
Wykorzystując wierzchołki pędów i pąki kątowe do mikrorozmnażania roślin nie oczekujemy od
komórek eksplantatu jakiejś radykalnej zmiany zachowania, w stosunku do tego jakie wykazywały
in planta
, czyli w hodowanej
ex vitro
, nie uszkodzonej roślinie. Wprawdzie pąki kątowe w
warunkach
in vivo
są zwykle uśpione, ale już sam fakt oddzielenia ich od wierzchołka łodygi
wyzwala je spod wierzchołkowej dominacji (narzuconej przy pomocy auksyn transportowanych w
dół łodygi) i pobudza ich rozwój. Dlatego do rozmnażania roślin przy pomocy wierzchołków
pędów i pąków pachwinowych wystarczyć mogą pożywki nie zawierające żadnych fitohormonów.
Z drugiej jednak strony, dodanie do pożywki fitohormonów, zwłaszcza cytokinin, przyspiesza
przełamywanie dominacji wierzchołkowej, nasila rozgałęzianie się pędów i zwiększa współczynnik
rozmnożenia. U niektórych gatunków od samej cytokininy korzystniej działa jej kombinacja z
auksyną, pobudzającą wydłużanie się pędów. Również giberelina GA
3
oraz kwas ferulowy mogą
sprzyjać namnażaniu pędów i ich prawidłowej budowie (długości międzywęźli, wielkości liści).
Spośród auksyn, w mikrorozmnażaniu roślin opartym na hodowlach wierzchołków pędów i pąków
kątowych, a także na organogenezie pędowej, najczęściej wykorzystuje się IAA, NAA lub IBA.
2,4-D natomiast okazuje się zwykle zbyt silną auksyną do tego celu i zamiast tworzenia się pędów
pobudza wzrost kalusa (natomiast w metodach opartych na somatycznej embriogenezie, najczęściej
wykorzystywaną auksyną jest właśnie 2,4-D, patrz niżej).
Dwie pierwsze z omawianych tu metod mikrorozmnażania nie różnią się istotnie od tradycyjnego
rozmnażania roślin przy pomocy sadzonek wierzchołkowych i odkładów (jakkolwiek zadowalają
się znacznie mniejszą ilością materiału wyjściowego). Wydaje się, że wszystkie gatunki
rozmnażane tymi tradycyjnymi metodami nadają się też do rozmnażania
in vitro
za pomocą
wierzchołków pędów lub pąków kątowych. Wśród roślin do rozmnażania których te metody
rzeczywiście są wykorzystywane w produkcji na dużą skalę, można wymienić m. in. maliny,
wiśnie, śliwy, jabłonie, winorośl, a także dalie, gerbery, storczyki, ziemniaki i wiele innych. U tych
gatunków z jednego eksplantatu można w ciągu roku "wyprowadzić" tysiące roślin potomnych. Co
kilka tygodni (zwykle co miesiąc) pędy odcinane są od tkanki macierzystej i pasażowane na świeżą
pożywkę namnażającą.
Pędy ziemniaka, zwłaszcza gdy są hodowane na pożywce o niskim potencjale osmotycznym
(zawartości sacharozy podwyższonej np. do 60 g/l), w niskiej temperaturze (ok. 10°C) i przy
krótkim dniu (8 godzinnym) mogą tworzyć tzw. mikrobulwy, czyli bulwy o średnicy zaledwie kilku
milimetrów. Tworzenie się mikrobulw nazywamy tuberyzacją
in vitro
(od ang.
tuber
- bulwa) i w
pracach nad mikrorozmnażaniem roślin traktujemy zwykle jako proces pożądany. Dodatkowo
można go pobudzić dodając do pożywki pochodną kwasu jasmonowego zwaną kwasem
tuberonowym. Mikrobulwy, można wysiewać do gleby jak nasiona, a przy tym są znacznie
wygodniejsze w manipulacji i odporniejsze na uszkodzenie niż młode sadzonki.
Organogeneza pędowa, bezpośrednia lub pośrednia, pozwala na uzyskanie jeszcze większego
współczynnika rozmnożenia niż hodowle wierzchołków pędów czy pąków kątowych. Pod
wpływem odpowiedniego zestawu fitohormonów, obejmującego w przypadku tej metody
zazwyczaj zarówno cytokininę, jak i auksynę, niektóre komórki ekskplantatu lub namnożonego na
nim kalusa wytwarzają zawiązki pędów - pąki. Czasami w obrębie jednego eksplantatu może się ich
tworzyć kilkadziesiąt. Tak bywa na przykład u popularnych roślin ozdobnych z rodziny
ostrojowatych, takich jak sępolia (
Saintapaulia
), syningia (
Sinningia
) czy skrętnik (
Streptocarpus
),
u których łatwo jest pobudzić powstawanie pędów przybyszowych w niewielkich
(kilkumilimetrowych) fragmentach blaszki liściowej i ogonków liściowych. Znamienne, że rośliny
te łatwo, choć nie aż tak wydajnie, dają się rozmnażać z liści również w warunkach
ex vitro
.
Rośliną bardzo wydajnie dającą się rozmnażać w ten sposób jest też tytoń, ale takich przykładów
można znaleźć dużo więcej. Już pod koniec ubiegłego wieku szacowano, że lista roślin, dla których
opublikowano metody mikrorozmnażania (którąkolwiek z powyższych metod) przekroczyła
sześćset gatunków i obejmowała praktycznie wszystkie rośliny ważne gospodarczo. U roślin
cebulowych, np. lilii, tulipanów, jako eksplantaty wykorzystuje się często kawałki liści
spichrzowych, a wynikiem hodowli jest tworzenie się drobnych, kilkumilimetrowych cebulek -
mikrocebul.
Wynik hodowli zależy od właściwości biologicznych rośliny, składu pożywki (a zwłaszcza rodzaju
i stężeń fitohormonów) a także warunków hodowli. Za wzorcowe, "klasyczne", uważa się dziś
badania wpływu auksyn i cytokinin na hodowle tkanek tytoniu, przeprowadzone przez Skooga. W
doświadczeniach tych okazało się, że najszybsze tworzenie kalusa następowało przy
umiarkowanych, niezbyt wysokich stężeniach auksyn i cytokinin. Zwiększenie zawartości auksyn
sprzyjało tworzeniu się przybyszowych korzeni, a podwyższenie zawartości cytokinin pobudzało
organogenezę pędową.
W procedurach mikrorozmnażania roślin w oparciu o wierzchołki pędów, pąki kątowe i
organogenezę pędową wyróżnić można kilka typowych etapów (nie wszyscy autorzy wyodrębniają
punkty pierwszy i ostatni; pozostałe natomiast etapy są na tyle jednoznacznie rozumiane, że
producenci ogłaszają krótko np. "sprzedam rośliny po III etapie mikrorozmnażania"):
0. Dobór materiału roślinnego
1. Założenie czystej (aksenicznej) kultury
2. Namnażanie pędów
3. Przygotowanie pędów do wykorzystania w warunkach
ex vitro
a. wydłużanie
b. ukorzenianie
c. (ewentualne wstępne hartowanie)
4. Przesadzenie roślin do gleby, hartowanie
Na etapach oznaczonych tu numerami 0 - 1 uwzględnia się wszystkie kryteria, o których
wspominaliśmy przy omawianiu ogólnych zasad doboru eksplantatu (por. rozdz. 1), a ponadto
zwraca się uwagę na te cechy biologiczne i użytkowe roślin matecznych, które odziedziczone przez
rośliny potomne, będą wyznaczać ich wartość handlową (np. barwa i wielkość kwiatów, pokrój
rośliny). W celu sprawdzenia skuteczności odkażania można niektóre eksplantaty umieścić na
typowych podłożach mikrobiologicznych, które lepiej niż pożywki dla roślin pobudzają wzrost
drobnoustrojów i pozwalają na szybsze ich wykrycie. Badanie obecności charakterystycznych
drobnoustrojów w eksplantatach, albo nawet w roślinach matecznych, z których eksplantaty dopiero
będą izolowane, nazywa się czasem z angielska indeksacją (ang.
indexing for pathogens
),
zwłaszcza jeśli wykorzystuje się w nich pożywki różnicujące, metody biochemiczne, albo rośliny
wskaźnikowe, dające bardzo charakterystyczne, silne reakcje na obecność jakiegoś drobnoustroju i
pozwalające na jego identyfikację.
Na etapie namnażania otrzymuje się bardzo dużą liczbę drobnych (kilkumilimetrowych) zawiązków
pędów. Przenosząc je na pożywkę zawierającą znacznie mniejsze stężenia regulatorów wzrostu, lub
wcale nie zawierającą fitohormonów, zatrzymuje się proces namnażania pędów, a pobudza ich
wzrost. Czasami na etapie wydłużania pędów wykorzystuje się pożywki zawierające węgiel
aktywny, który pochłania pozostałości fitohormonów przenoszone wraz z materiałem roślinnym z
poprzedniego etapu hodowli. Ukorzenianie pędu i jego wzrost mogą zachodzić na tej samej
pożywce. W razie potrzeby ukorzenianie może być pobudzane przez dodatek niewielkiej ilości
auksyny takiej jak IAA, IBA lub NAA.
Konieczność hartowania regenerowanych
in vitro
roślin wynika z dużej różnicy pomiędzy
warunkami środowiska
in vitro
i
ex vitro
. Przede wszystkim chodzi tu wilgotność powietrza (w
kulturach
in vitro
często bliską 100%) oraz obecność cukru i innych związków organicznych w
pożywce, przy ich niemal zupełnym braku w glebie. Zabieg hartowania, a nawet ukorzeniania,
może być przeprowadzony (a zwłaszcza kontynuowany) już po przesadzeniu roślin do gleby. Przez
okres 1 - 2 tygodni utrzymywana jest wysoka wilgotność powietrza (rośliny mogą być osłonięte
tunelami foliowymi) i dość niskie natężenie światła (zacienienie). Później stopniowo usuwa się
osłony zmuszając rośliny do adaptowania się do warunków właściwej uprawy
ex vitro
.
Metodą mikrorozmnażania, która powinna dać się stosunkowo łatwo automatyzować, a więc
okazać się stosunkowo mało pracochłonną, tanią, jest wykorzystanie somatycznych zarodków.
Skoro mówimy o zarodkach somatycznych, to dla jasności sprawy uzgodnijmy od razu jakie w
ogóle rodzaje roślinnych zarodków będziemy wyróżniać. Ogólnie dzieli się je na zygotyczne i
niezygotyczne czyli apomiktyczne. Somatyczne należą oczywiście do tej drugiej grupy. Do
zarodków apomiktycznych poza somatycznymi, zalicza się jeszcze zarodki partenokarpiczne,
powstające z żeńskiego gametofitu, a zwłaszcza należącej do niego komórki jajowej i
androgeniczne, powstające z mikrospory (niedojrzałego ziarna pyłku) lub męskiego gametofitu
(kiełkującego ziarna pyłku). Wszystkimi zarodkami innymi niż somatyczne będziemy się zajmować
w dalszej części tego podręcznika. Dodajmy, że czasami obserwujemy zarodki somatyczne
wyrastające na powierzchni innych, starszych zarodków, somatycznych lub zygotycznych. Taki
szczególny rodzaj zarodków somatycznych nazywamy przybyszowymi lub dodatkowymi.
Zarodki somatyczne i zygotyczne są oczywiście podobne nie tylko z nazwy, ale wykazują podobną
budowę i podobne przemiany rozwojowe - pojedyncza komórka, drobne agregaty komórkowe,
zarodek kulisty (globularny), sercowaty, torpedowaty (hodowcy roślin czasem mówią "stadium
torpedo" bo torpeda to po angielsku właśnie
torpedo
) i stadium liścieniowe. W wyniku wzrostu,
zarodki przekształcają się ostatecznie w rośliny. Wydaje się, że somatyczną embriogenezę (SE)
można wywołać u wszystkich gatunków roślin, ale widoczne są duże różnice gatunkowe i
genotypowe w zdolności do SE. Stosunkowo łatwo uzyskuje się to zjawisko np. u marchwi,
kalafiora selera, rzepaku, cytryny, kawy, a z gatunków rolniczych - lucerny.
Somatyczną embriogenezę pobudzają warunki hodowli, a mianowicie obecność auksyny
(zwłaszcza silnych, syntetycznych auksyn jak 2,4-D i pikloram), odpowiedni (wysoki) stosunek
azotu amonowego do azotanowego, dość wysokie pH (ok. 7). W niektórych hodowlach indukująco
może działać obecność określonych aminokwasów (zwłaszcza kwasu glutaminowego i proliny) lub
kwasów organicznych. Również obecność cytokininy sprzyja zapoczątkowaniu SE, a szczególnie
skuteczna pod tym względem bywa zeatyna. Działanie egzogennej auksyny konieczne jest tylko we
wstępnej fazie somatycznej embriogenezy. Później (po okresie kilku dni do miesiąca) hodowle
przenoszone są na pożywkę, która albo auksyny nie zawiera, albo zawiera jej dużo mniej niż
[ Pobierz całość w formacie PDF ]

Linki

: 20130910090649 Cierpiałkowska Podstawy pomocy, Psychologia USWPS Warszawa, Podstawy pomocy psychologicznej - Cierpiałkowska

: 2005.RW.Beilare.Opong, Wydział Zarządzania WZ WNE UW SGH PW czyli studia Warszawa kierunki matematyczne, WNE UW