3. Izolacja i analiza lipidów, Weterynaria, Biologia komórki, Molekularna organizacja komórki

3. Izolacja i analiza lipidów

3. Izolacja i analiza lipidów, Weterynaria, Biologia komórki, Molekularna organizacja komórki

[ Pobierz całość w formacie PDF ]
1.2. Izolacja i analiza lipidów
21
szkło podstawowe;
kolba do wyparki;
wyparka próżniowa.
Postępowanie:
• 20 g liści lub 25 ml upakowanych chloroplastów umieścić w rozdzielaczu na
500 ml.
• Dodać 100 ml metanolu i wytrząsać przez kilka minut.
• Dodać 200 ml chloroformu i całość wytrząsać przez obracanie przez kilka
minut.
• Dodać 100 ml metanolu i dodatkowo mieszać przez chwilę.
• Dodać 150 ml roztworu chlorku sodowego i mieszać całość przez dodatkowe
kilka minut.
• Pozostawić na co najmniej 30 min dla rozdzielenia faz.
• Zebrać fazę dolną (około 200 ml).
• Do fazy górnej dodać 200 ml chloroformu i całość mieszać przez kilka minut;
pozostawić do rozdzielenia faz.
• Zebrać fazę dolną i połączyć ją z zebraną poprzednio fazą dolną.
• Do połączonych faz dodać 200 ml roztworu NaCl i wytrząsać przez kilka
minut; pozostawić na 60 min dla rozdzielenia faz.
• Zebrać fazę dolną i odparować z niej rozpuszczalnik. Dla ułatwienia odparo-
wania wody dodać do fazy dolnej izopropanolu (około 50 ml). Uzyskane
lipidy przechowywać w -70°C rozpuszczone w małej ilości chloroformu.
1.2. Izolacja i analiza lipidów
Po wyekstrahowaniu lipidów zwykle rozdziela się je na grupy na podstawie
różnic w rodzaju i ilości grup jonowych (fosforanowych, aminowych) i niejono-
wych (hydroksylowych, karbonylowych) obecnych w ich cząsteczkach. Do tego
celu stosuje się najczęściej techniki chromatograficzne. Do całkowitego rozdzie-
lenia mieszaniny lipidów stosuje się różne techniki chromatograficzne.
a) Chromatografia adsorbcyjna
Może być prowadzona na kolumnach w chromatografii cieczowej (LC, HPLC)
2
lub cienkich warstwach (TLC)
3
, najczęściej żelu krzemionkowego, w celu roz-
dzielenia złożonej mieszaniny na poszczególne klasy lipidów. Obserwowana
czasami tendencja do rozdzielania się lipidów w obrębie danych klas nie wpływa
na rozdział samych klas. W odpowiednich warunkach można rozdzielić węglo-
wodory, alkohole, aldehydy i kwasy tłuszczowe, a także frakcjonować poszcze-
gólne typy fosfoglicerydów czy też glikolipidów.
2
LC - Liquid Chromatography, HPLC - High Performance (Pressure) Liquid Chromatography.
3
TLC - Thin Layer Chromatography.
1. Lipidy
22
b)
Chromatografia argentacyjna
Chromatografia jest prowadzona na kolumnach lub warstwach żelu krzemionko-
wego impregnowanego solami srebra, najczęściej azotanem srebrowym. Pozwala
ona na rozdzielenie każdej klasy lipidów na grupy związków posiadających tę
samą liczbę i konfigurację wiązań podwójnych. Np. alkohole alifatyczne mogą
być równocześnie rozdzielane na nasycone, jedno-, dwu- i trójnienasycone, a tak-
że na izomery
cis
i
trans
nienasycone. Zasada rozdziału polega na niskoenerge-
tycznym kompleksowaniu elektronów π wiązań podwójnych z jonami Ag
+
, które
występuje i jest zrywane podczas normalnego procesu chromatograficznego. Je-
żeli w czasie chromatografii część soli srebra ulega wymywaniu eluentem, nie
powoduje to zaburzeń w samym rozdziale. Sól srebrową obecną we frakcji lipido-
wej po rozdziale można usunąć przez rechromatografię na samym żelu krzemion-
kowym lub przez jej przemycie wodą.
c) Chromatografia faz odwróconych (Reversed Phase, RP)
Jest techniką rozdzielania mieszanin realizowaną przy użyciu różnych nośników,
modyfikowanym parafiną a obecnie najczęściej chemicznie żelu krzemionko-
wym. Modyfikowane chemicznie żele mają przyłączone do reszt silanolowych
(SiOH) alifatyczne łańcuchy węglowodorowe o różnej długości. Wraz z ich zwię-
kszeniem zwiększa się hydrofobowość nośnika. Takie chemicznie modyfikowane
żele mają w nazwie dodatkowe oznaczenie RP od „Reversed Phase". Obecnie
najczęściej stosuje się nośniki typu RP-2, RP-8 oraz RP-18, zwane też ODS (od
„octadecylsilica"). Elucję w tej technice prowadzi się z reguły układami dwu-
składnikowymi, z których jednym jest zawsze woda, np. metanol-woda, acetoni-
tryl-woda, aceton-woda. Technika faz odwróconych umożliwia rozdzielanie
mieszanin związków różniących się długością łańcucha lub też liczbą wiązań
podwójnych. Ponieważ stwierdzono, że w porównaniu do związku nasyconego
jedno wiązanie podwójne wywołuje efekt identyczny, jak skrócenie łańcucha
o dwa atomy węgla, dlatego rozdzielenie mieszanin zawierających homologi róż-
niące się zarówno długością, jak i liczbą wiązań podwójnych jest zwykle niemo-
żliwe. Stosując jednak chromatografię na fazach odwróconych w obecności soli
srebrowych, opisaną powyżej mieszaninę można rozdzielić.
d) Chromatografia jonowymienna
Wykazano, że lipidy niejonowe, obojnacze (zwitterjonowe) i kwaśne mogą być
efektywnie rozdzielane na kolumnach wypełnionych wymieniaczami jonowymi.
Najczęściej stosuje się pochodne celulozy - DEAE-celulozę i CM-celulozę.
e) Chromatografia gazowo-cieczowa
Technika ta umożliwia rozdział składników mieszaniny lipidów po ich przepro-
wadzeniu w lotne pochodne zarówno w zależności od długości łańcucha, jak i od
liczby wiązań podwójnych. Osiąga się również oddzielenie i rozdział związków
o łańcuchach prostych od związków mających łańcuchy rozgałęzione. Często
udaje się nawet rozdział izomerów konformacyjnych.
l 2. Izolacja i analiza lipidów
23
Zasady chromatografii oraz techniki są bardziej szczegółowo opisane np. w książ-
ce
Chromatografia i jej zastosowania,
A. Berthillier, PWN, Warszawa 1975.
1.2.1. Frakcjonowanie lipidów
metodą chromatografii na CM-celulozie
(wg Comfurius P., Zwaal R. F. A., Biochim. Biophys. Acta 488 (1977) 36-42)
Materiały i odczynniki:
karboksymetyloceluloza drobnoziarnista, forma sodowa (CM-52);
metanol;
chloroform.
Sprzęt:
kolumna szklana np. 2.5 x 30 cm z zaworem teflonowym;
rozdzielacz ze szlifem pasującym do wlotu kolumny;
zlewki do zbierania frakcji;
(azot w butli).
Przygotowanie kolumny:
Zregenerowaną i napęczniałą celulozę zawiesić w metanolu i dekantować kilka-
krotnie dla usunięcia bardzo drobnych włókien. Na dnie kolumny umieścić korek
z waty szklanej i wypełnić kolumnę w 1/3 metanolem. Wymieszać dokładnie
celulozę tak, by uzyskać jednorodną zawiesinę. Część zawiesiny (ok. 1/4) wlać do
kolumny uważając, by nie wprowadzić pęcherzyków powietrza. Podłączyć do
kolumny azot o zwiększonym ciśnieniu, tak by nadmiar metanolu został dosyć
szybko przepchnięty przez formujące się złoże. Dodać następną porcję zawiesiny
CM-celulozy i powtórzyć operację. Postępując w ten sposób wypełnić kolumnę
do 2/3-3/4 wysokości złożem. Powierzchnię złoża zabezpieczyć korkiem z waty
szklanej oraz warstwą kulek szklanych (ok. 1-2 cm grubości) dla ochrony przed
uszkodzeniem celulozy w czasie nanoszenia próbek oraz zmiany rozpuszczalni-
ków. Kolumnę przechowywać dbając o zachowanie warstwy rozpuszczalnika nad
powierzchnią złoża.
Rozdział mieszaniny lipidów:
Przed naniesieniem próbki metanol z kolumny należy wymyć przez jej przemycie
10 obj. (tu: l obj. kolumny jest równa objętości zajętej przez przygotowane złoże)
chloroformu. Próbkę lipidów w roztworze chloroformowym o stężeniu do 50
mg/ml nanieść na kolumnę pamiętając, by nie przeładować kolumny (maksymal-
na pojemność złoża - 5 mg lipidu na l ml objętości złoża). Po naniesieniu próbki
i przemyciu ścianek kolumny lipidy eluuje się z szybkością do 250 ml/godz,
(można pomagać sobie ciśnieniem azotu) podanymi w Tabeli l roztworami meta-
nolu w chloroformie.
1. Lipidy
24
Tabela 1.
Schemat elucji klas lipidowych z CM-celulozy
% metanolu w chloroformie
eluowany lipid
0-2
wolne kwasy tłuszczowe, cholesterol,
pigmenty, glicerydy
dwufosfatydyloglicerol
fosfatydylocholina
sfingomielina, monogalaktodwuglicerol
fosfatydyloetanolamina
kwas fosfatydowy
dwugalaktodwuglicerol
fosfatydyloglicerol
lizofosfatydylocholina
fosfatydyloseryna
fosfatydyloinozytol
regeneracja
3
4
5
9
12.5
14-15
19-20
23
30-35
50
100, a następnie 0 (po 10 obj.)
Po elucji 5 obj. każdej mieszaniny skontrolować eluent na obecność danego
lipidu. Jeżeli będzie jeszcze obecny, to należy kontynuować elucję jeszcze 2 obj.
tego samego układu. Eluent zbierać we frakcjach o wielkości równej l obj. kolumny.
Zatrzymanie elucji na noc nie wpływa na jakość rozdziału. Frakcje analizować na
zawartość lipidów w chromatografii cienkowarstwowej na żelu krzemionkowym
w dowolnym układzie, np. chloroform/metanol/kwas octowy/woda (60:50:1:4). Fra-
kcje zawierające czyste lipidy połączyć i odparować w wyparce próżniowej. Lipidy
rozpuścić w określonej ilości chloroformu i przechowywać w -70°C.
Procedurę można przystosować do rozdziału 1g próbek mieszaniny lipidów.
1.2.2. Rozdział fosfolipidów w wysokociśnieniowej
chromatografii cieczowej (HPLC)
(wg Shefiq-ur-Rehman, J. Chromatogr. 567 (1991) 29-37)
Materiały i odczynniki:
ekstrakt lipidów z materiału biologicznego;
acetonitryl (HPLC-grade);
metanol (HPLC-grade);
kwas o-fosforowy 85%;
n-heksan;
izopropanol;
(standardy fosfolipidów - PC, PE, PS, SM).
Sprzęt:
chromatograf cieczowy wraz z detektorem UV;
kolumna 250 x 4.6 mm wypełniona żelem krzemionkowym;
podstawowe szkło laboratoryjne.
l 2. Izolacja i analiza lipidów
25
Postępowanie:
• Przygotować układ elucyjny - acetonitryl/metanol/kwas fosforowy (100:10:1.8)
i odgazować go przy użyciu pompy próżniowej.
• Zrównoważyć kolumnę przez przepompowanie przez nią przez 30 min układu
przy przepływie 1.5 ml/min. Detektor ustawić na 203 nm.
• Znaną ilość ekstraktu przenieść do probówki i odparować rozpuszczalnik
w strumieniu azotu. Suchą pozostałość rozpuścić w mieszaninie heksanu
z izopropanolem (3:1), tak by stężenie lipidów było równe ich stężeniu w ory-
ginalnym ekstrakcie.
• Za pomocą mikrostrzykawki wprowadzić 50 μl próbki do systemu nastrzyko-
wego a następnie na kolumnę, zaznaczyć punkt wstrzyknięcia na papierze
rejestratora.
• Rozdział prowadzić do chwili wymycia wszystkich frakcji (około 15 min).
Orientacyjne czasy retencji wynoszą:
PS - 3 min; PE - 4 min; PC - 6 min; SM - 8 min.
Alternatywnie można użyć innych układów:
a) acetonitryl/metanol/kwas fosforowy (100:40:0.8) - rozdział trwa około 30
min,
b) acetonitryl/metanol/kwas siarkowy (100:3:0.05) - rozdział przy przepły-
wie l ml/min trwa około 50 min.
Stosując metodę triangulacyjną obliczyć powierzchnie szczytów, a następnie
procentową zawartość poszczególnych lipidów w analizowanym ekstrakcie.
1.2.3. Analiza fosfolipidów
w chromatografii cienkowarstwowej
(wg Higgins J. A., w: Biological membranes - a practical approach (red. Findlay J. B. C.,
Evans W. H.), IRL Press, Oxford 1987, s. 103-137)
Materiały i odczynniki:
ekstrakt lipidów;
płytki do TLC powleczone żelem krzemionkowym;
chloroform;
metanol;
kwas octowy;
kryształki jodu (w pojemniku).
Sprzęt:
komora chromatograficzna;
mikrokapilary do nanoszenia próbek;
suszarka.
[ Pobierz całość w formacie PDF ]

Linki

: 2007 listopad, MATURA, arkusze maturalne + egzamiany wstepne, biologia, 2007

: 2005 grudzień, MATURA, arkusze maturalne + egzamiany wstepne, biologia, 2005