2. Poznawanie białek i proteomów, Biotechnologia PWR, Semestr 3, Biochemia I - ćwiczenia (Jakób), Notatki ze Stryera, Notatki 1-2

2. Poznawanie białek i proteomów

2. Poznawanie białek i proteomów, Biotechnologia PWR, Semestr 3, Biochemia I - ćwiczenia (Jakób), Notatki ze ...

[ Pobierz całość w formacie PDF ]
//-->Poznawanie białek i proteomówProteom– nazwa wywodzi się odproteinsigenomei oznacza białka powstałe w wyniku ekspresji genomu.Aktywność enzymu– jego zdolnośd do katalizowania określonej reakcji chemicznej.Aktywność specyficzna– stosunej aktywności enzymatycznej do ilości białka w próbie badanej.Metody oczyszczania i rozdziału białek:WysalanieDializaChromatografia metodą filtracji żelowejChromatografia jonowymiennaChromatografia powinowactwaWysokociśnieniowa chromatografia cieczowa (HPLC)Elektroforeza żelowa (w tym elektroforeza typu SDS-PAGE)Ogniskowanie izoelektryczneElektroforeza dwukierunkowaPomiar aktywności specyficznej1.Białko ogólne– ilośd białka obecna we frakcji; stężenie białka w próbie pobranej pomnożone przez objętośdfrakcji.2.Aktywność ogólna– aktywnośd enzymatyczna frakcji; aktywnośd enzymatyczna w objętości próby pobranej zfrakcji pomnożona przez objętośd całkowitą frakcji.3.Aktywność specyficzna– ten parametr wyznaczamy dzieląc aktywnośd ogólną przez ilośd białka ogólnego.4.Wydajność– miara aktywności uzyskanej na każdym etapie oczyszczania. Wyrażamy ją w % aktywnościsurowego ekstraktu (aktywnośd w początkowym wynosiła 100%).5.Stopieo oczyszczenia– miara wzrostu czystości preparatu białka; aktywnośd specyficzna podzielona przezaktywnośd enzymu początkowego.Pomiar masy cząsteczkowej– ultrawirowanieSekwencja aminokwasów– degradacja EdmanaFluoreskamina– reaguje z grupą α-aminową, tworząc silnie fluoryzujący produkt.Fenyloizotiocyjanian– reaguje z wolną koocową grupą aminową peptydu (koniec N).Odczynniki wykorzystywane do identyfikacji N-kooca:Chlorek dabsyluFenyloizotiocyjanianFluorodinitrobenzenTWÓJ BIOTECHNOLOGhttps://www.facebook.com/twoj.biotechnologPoznawanie białek i proteomówBiałka można rozcinad na małe peptydy w celu ułatwienia sekwencjonowania (nakładającesię polipeptydy):1. Trawienie chemiczneBromocyjan – przy COOH reszt metioninowychO-jodobenzen– przy COOH reszt tryptofanowychHydroksyalamina – wiązanie asparagina-glicyna2-Nitro-5-tiocyjanobenzen – aminowa strona reszt cysteiny2. Trawienie enzymatyczneTrypsyna – przy COOH reszt lizyny i argininyKlostrypaina – przy COOH reszt argininyProteaza – przy COOH reszt asparaginianu i glutaminianuTrombina – przy COOH argininyChymotrypsyna – przy COOH tyrozyny, tryptofanu, fenyloalaniny, leucyny, metioninyKarboksypeptydaza A – aminowa strona C-kooca wszędzie oprócz argininy, lizyny i proliny.Wiązanie przy COOHCNBrO-jodobenzenTrypsynaProteazaTrombinaKlostrypainaChymotrypsynaWiązanie po aminowej stronie2-Nitro-5-tiocyjanobenzenKarboksypeptydaza A (C-koniec)Konkretne wiązanieHydroksyalaminaaminokwasMetTrpLys, ArgAsp, GluArgArgTyr, Trp, Phe, Leu, MetCysWszystkie – {Arg, Pro, Lys)Asn-GlyTest immunoenzymatyczny ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)Wykorzystujemy tu enzym związany kowalencyjnie ze specyficznym przeciwciałem, które rozpoznaje określonyantygen, reaguje z bezbarwnym substratem, przekształcając go w barwny produkt.Test pośredniTWÓJ BIOTECHNOLOGhttps://www.facebook.com/twoj.biotechnologPoznawanie białek i proteomówTest warstwowy (ma na celu wykrycie przeciwciał)Technika western (Western blotting)Próbę z białkami poddaje się elektroforezie na żelu poliakryloamidowymm z SDS, a białka rozdzielone na żeluprzenosi (przez odciśnięcie –blotting)na filtr nitrocelulozowy, na którym białko ma lepsze warunki reakcji z podanymnastępnie swoistym dla niego przeciwciałem. Powstały w wyniku reakcji kompleks przeciwciało-antygen możnawykryd przemywając go drugim przeciwciałem, specyficznym dla pierwszego. Radioaktywne piętno drugiegoprzeciwciała powoduje pojawienie się ciemnego prążka na kliszy rentgenowskiej (autodiagram). Albo też enzymzwiązany z drugim przeciwciałem tworzy barwny produkt, jak w teście ELISA. Technika western umożliwia znalezienieposzukiwanego białka w złożonej mieszaninie.Wykrywanie białek w ich biologicznym środowisku:Mikroskopia fluorescencyjnaMikroskopia immunoelektronowaSynteza peptydów na stałym podłożuGrupę α-aminową pierwszego aminokwasu blokuje się grupątert-butyloksykarbonylową (t-Boc).Grupę karboksylową tego samego aminokwasu aktywuje się w reakcji zdicykloheksylokarbodiimidem(DCC).Atakwolnej grupy aminowej następnego aminokwasu na zaaktywowany karboksyl prowadzi do utworzenia wiązaniapeptydowego i uwolnienia dicykloheksylomocznika. Grupę karboksylową powstałego dipeptydu aktywuje się zapomocą DCC i poddaje reakcji z wolną grupą aminową następnego aminokwasu. Przemycie peptydu rozcieoczonymkwasem usuwa osłaniającą grupęt-Bocz pierwszego aminokwasu bez uszkodzenia wiązao peptydowych.Charakteryzowanie i identyfikowanie białek – spektometria masMALDI (matrix-assisted laser desorption-ionization)– badane białko lub peptyd współwytrąca się ze związkiemorganicznym, który absorbuje światło laserowe o odpowiedniej długości fali. Padające na preparat światło laserowewybija cząsteczki z jego powierzchni. Wychwytują one elektrony w trakcie wychodzenia z matrycy i stają się ujemnienaładowanymi jonami.ESI (elecreospray ionization)– r-ry zawierające białko lubv peptyd przepuszcza się przez cienką metalową koocówkę, doktórej jest przyłożony potencjał elektryczny. Uwalniają się małe, elektrycznie naładowane kropelki zawierające biało irozpuszczalnik. Jego parowanie z kropelek zwiększa stopieo zagęszczenia ładunku. Wzrasta wzajemne odpychaniepodobnie naładowanych cząstek, wskutek czego jony poszczególnych cząsteczek rozpraszają się. Jony te na ogół mająładunek wielokrotny.TOF (time of flight)Oznaczanie struktury przestrzennej białekKrystalografia rentgenowskaNMR - spektroskopia magnetyczna rezonansu jądrowegoTWÓJ BIOTECHNOLOGhttps://www.facebook.com/twoj.biotechnolog [ Pobierz całość w formacie PDF ]

Linki

: 2008-Metody obliczeniowe-08-D-2008-11-11-21-31-58, Inżynierskie, Semestr III, Metody obliczeniowe, Wyklady

: 2008-Metody obliczeniowe-07-D-2008-10-29-19-28-1, Inżynierskie, Semestr III, Metody obliczeniowe, Wyklady